Ako používať GSH úrovne pri detekcii ROS

Glutatión , alebo GSH , je neesenciálna tripeptid z cysteín , glutamát a glycín . Je to silný antioxidant , ktorý chráni bunky a orgány vášho tela pred škodlivými účinkami ROS , alebo reaktívnych kyslíkových radikálov , ktoré sú tvorené z molekulárneho kyslíka v dôsledku rôznych metabolických procesov v tele . Antioxidanty, ako je glutatión , neutralizujú ROS a zabrániť im v interakcii s a poškodenia DNA a bielkovín vo vašich bunkách . Pomer oxidované a redukované formy GSH v tele svedčia o ROS súvisiace oxidatívneho stresu vo vašom body.Things budete potrebovať
striekačka
Butterfly ihly
odstredivka
heparín sodný
Mraznička
kyselina sulfosalicylovou
GSH Reaction agenta
Mikrodoštička
Svetelný zdroj klipart štandardného roztoku GSH
Zobraziť ďalšie inštrukcie Cestuj 1

Draw približne 2 ml krvi zo žily na anticubetal žily s 23 - gauge butterfly ihlou až 5 ml injekčnej striekačky . Pridať vzorky do skúmaviek obsahujúcich heparín sodný a jemne invertovať trubice pre miešanie .
2.

zbierať červené krvinky odstredením vzorky pri 2500 otáčkach za minútu po dobu piatich minút . Zmraziť a rozmraziť Vzorka sa trikrát rozbiť bunky . Odstredivka bunkového lyzátu riešenie po dobu 10 minút pri 12000 otáčkach za minútu a 4 stupne , a zbierať supernatant .
3

Vyberte proteín zo vzorky pridaním 5 percent kyseliny sulfosalicilovej a centrifugáciu vzorky 12000 rpm po dobu piatich minút pri teplote 4 ° . Skladujte deproteinated supernatant na -112 stupňov .
4

Mix detekčné činidlo tiolové , GSH reduktázy , nikotínamid - adenín - fosfát dinukleotidovou a skúšobným pufra v pomere podľa výrobcu kitu , aby GSH reakčnej zmesi . Množstvo každej chemickej látky závisí od počtu testov , ktoré chcete vykonať . GSH sa reakčná zmes zriedi v 5 percent kyseliny sulfosalicilovej , aby sa koncentrácia 16 , 32 , 63 , 125 , 250 a 500 mikrolitrov .
5

Pridať 1-10 mikrolitrov vzorky deproteinated krvi do jamiek z mikrotitračné doštičky . Pridať sériovo zriedený štandardný roztok GSH , ktorý je k dispozícii v testovacej sade , do každej jamky , aby celkový objem každej jamky 10 ul
6

Pridať 90 ul GSH reakčnej zmesi , ktoré ste vykonali v kroku 4 , do každej jamky v mikrotitračnej doštičky . Zmiešajte činidlo pretrepaním doštičku po dobu 30 sekúnd .
7

okamžite Zmeria sa absorbancia umiestnením dosky pod svetlom s vlnovou dĺžkou 405 a 415 nanometrov . Inkubujte doštičku po dobu 30 minút . Vezmite absorbancie po každých päť minút počas inkubácie .
8

Rozpustite 6 mM spracovaného vzorky s 5 percent kyseliny sulfosalicylovou a trifluromethane sulfonátového riešenie . Tým sa odstránia všetky zníženie GSH z roztoku . Pridať medzi 1 až 10 micoliters tohto riešenia do jamiek mikrotitračnej doštičky a opakujte kroky 5 , 6 a 7. To vám pomôže odhadnúť množstvo oxidovaného GSH vo vzorke .
9

Plot absorbanciu vzorky a koncentrácie na grafe získať krivku GSH ako pre zníženie a oxidovaného glutatiónu . Vypočíta sa pomer medzi oboma formami GSH . Zvýšené hladiny oxidatívny hladiny GSH ukazujú , oxidačný stres a ROS .